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人神經生長因子酶聯免疫分析(NGF)ELISA試劑盒使用說明書

更新時間:2010-02-24   點擊次數:2704次

本試劑盒僅供研究使用
預期應用
ELISA法定量測定人血清、血漿、細胞培養物上清或其它相關液體中NGF含量。
實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中NGF水平。用純化的抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入NGF抗原、生物素化的抗人NGF抗體、HRP標記的親和素,經過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的NGF呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1.酶聯板:一塊(96孔)
2.標準品(凍干品):2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復顛倒/搓動以助溶解,其濃度為1000 pg/mL,做系列倍比稀釋后,分別稀釋成1000 pg/mL,500 pg/mL ,250 pg/mL,125 pg/mL,62.5 pg/mL,31.2 pg/mL,15.6 pg/mL,其原液直接作為zui高標準濃度,樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/mL,臨用前15分鐘內配制。
如配制500 pg/mL標準品:取0.5ml 1000 pg/mL的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。
3.樣品稀釋液:1×20ml/瓶。
4.檢測稀釋液A:1×10ml/瓶。
5.檢測稀釋液B:1×10ml/瓶。
6.檢測溶液A:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔100ul),實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內配制。
7.檢測溶液B:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8.底物溶液:1×10ml/瓶。
9.濃洗滌液:1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.終止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
標本的采集及保存
1.細胞培養物上清:請離心后收集上清,并將標本保存于-20℃,且應避免反復凍融。
2.血清:標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融。
3.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,或將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融。
注:標本溶血會影響zui后檢測結果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。
1.加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。除空白孔外,余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul,注意不要有氣泡,輕輕混勻,酶標板加上蓋,37℃反應120分鐘。
2.棄去液體,甩干,不用洗滌。
3.每孔加檢測溶液A工作液 100ul,37℃,60分鐘。洗板3次,350ul/每孔,甩干。
4.每孔加檢測溶液B工作液 100ul,37℃,60分鐘,洗板5次,甩干。
5.依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光顯色30分鐘(此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯)。
6.依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(此時蘭色立轉黃色)。用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。
注:
1. 每次實驗留一孔作為空白調零孔,該孔不加任何試劑,只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。
2.為防止樣品蒸發,試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內,浸泡1-2分鐘,根據需要,重復此過程數次。
自動洗板:如果有自動洗板機,應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人NGF,且與其它相關蛋白無交叉反應。
計算
  以標準物的濃度為橫坐標(對數坐標),OD值為縱坐標(普通坐標),在半對數坐標紙上繪出標準曲線,根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數;或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數,即為樣品的實際濃度。
注意事項
1.洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。
2.一次加樣時間控制在5分鐘內,如標本數量多,推薦使用排槍加樣。
3.請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。
4.如標本中待測物質含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請zui后乘以稀釋倍數。
5.在配制標準品、檢測溶液工作液時,請以相應的稀釋液配制,不能混淆。
6.底物請避光保存。
檢測范圍:
15.6 pg/mL -1000 pg/mL
說明
1.試劑盒保存:-20℃(較長時間不用時);2-8℃(頻繁使用時)。
2.有效期:6個月
3.濃洗滌液會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。
4.剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質,此為正常現象,不會對實驗結果造成任何影響。
5.中、英文說明書可能會有不一致之處,請以英文說明書為準。

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